使用滤光片优化荧光和拉曼系统中的照明

介绍

美国艺达思健康与科学有限公司 | 20 多年来，Semrock 一直致力于提供荧光滤光片。我们的超陡过渡边缘、深度阻挡和高透射率树立了好标准，并帮助推动了新型、更高性能光学系统的创建。在本说明中，您将学习如何使用我们的产品来利用您的荧光和拉曼激发设计，无论光源是什么。

荧光光谱、光度测定和显微镜应用于生物和医学科学中。当分子被电子激发到更高的能级，然后发生小的非辐射衰变（产生斯托克斯位移，图 1），然后发射光子并返回基态时，就会出现标准荧光。与吸收的光相比，斯托克斯位移导致发射光的波长转变为更长。这种光谱分离允许科学家使用一系列荧光滤光片或色散元件（例如，光栅或棱镜）用一个波长带的光激发，并同时检测另一个较长波长带的光。

无论光源如何，为了在荧光系统中实现良好的信噪比 (SNR)，到达样品的照明光都应强烈激发那里的分子，并且理想情况下传输的波长范围包括分子的峰值激发荧光团。荧光常用的照明源主要有三种类型：宽带、白光源（例如弧光灯）、LED 和多 LED 光引擎以及激光器。我们将以相反的顺序处理这些，从激光开始。

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使用窄带通激光滤光片优化激发

激光器虽然从头开始设计起来很复杂，但使用起来相对简单。激光器有多种类型，采用不同的激光介质并具有不同的特性，包括气体激光器、二极管激光器、DPSS 激光器、VCSEL 等。无论哪种激光介质，激光的特点都是窄发射光谱（使用 Semrock 带通激光线消杂滤光片系列以优化激光）和相干光束，使激光器成为多标记荧光实验中多重分析的理想选择。选择能够大限度地激发感兴趣的荧光团的波长的激光。通过使用一系列离散的激光波长， 可以在单个系统中激发和检测多种染料。

图 1. 典型荧光团的激发和发射光谱，组合光源选择。

尽管主激光线在发射的光中占主导地位，但激光通常会产生其他发射，例如放大的自发发射。这些通常更宽且更弱，可能会干扰敏感的低光测量，例如弱或单光子荧光和拉曼光谱。这种潜在的背景发射可以通过在激光输出前面放置一个强烈阻挡激光线（长通或 OD6+ 窄槽口）的滤光片并在白卡上观察通过的其他颜色或使用光谱仪来检测。这种杂散信号可以用窄带通滤光片（也称为激光线或消杂、净化滤光片）来抑制。 Semrock 提供多种常用波长的窄带通激光滤光片。这些激光滤光片在激光波长下提供高的透射率，具有陡峭的过渡边缘和在荧光检测范围（“红色侧”）上的阻挡，以及激光线“蓝色侧”的更有限的波长范围。

虽然激光滤光片需要窄带宽，但带宽和信噪比之间存在一个平衡点 - 如果您从头开始设计系统，则需要考虑这一点。一般来说，激光滤光片的半高全宽 (FWHM) 越窄，SNR 越高。然而，激光线滤光片还应该足够宽，以适应由于温度（某些激光器在升温时波长会显着偏移）和老化以及入射角偏移（具体取决于您的系统）引起的激光漂移。

拉曼应用涉及具有小的斯托克斯位移的激光散射，该位移对应于分子中的振动模式，以波数 - cm^-1 测量。对于这项工作，应增加激光线滤光片的边缘陡度并减少 FWHM，以获得好的实验结果。斯托克斯和反斯托克斯检测都需要至少 OD 6 的近带阻挡，以便在激光波长处存在弹性（瑞利）散射的情况下可视化低波数信号。

使用 LED 带通滤光片和多通道照明优化激发

LED 的光谱相对较窄，可以与目标荧光团的激发光谱紧密匹配（图 2）。这一点及其低成本使它们成为荧光系统的理想选择。与激光滤光片一样，来自这些光源的光必须在检测波长范围内被阻挡，以减少散射背景（LED 激发）信号到达检测器。 Semrock 建议“交叉点”（以 OD 绘制时激发滤光片光谱和发射滤光片光谱相交的波长）处的有效 OD 约为 7，这意味着激发滤光片和发射滤光片提供的阻挡应分别超过 3.5 OD 单位（图 3 ）。

OD 6+ 阻挡范围还必须扩展到 LED 发射发生的波长（图 3）。请注意，OD 值本质上是相加的，因此当同时使用多个滤光片时，可以添加光谱来预测总体性能。

图 2.LED 光谱可能与激发光谱相似， 但与发射光谱可能存在显着重叠。	图 3. 在 LED 的发射范围内需要高的 OD 阻挡。在本例中约为 70 nm（530-600 nm）。

对于使用许多 LED 和荧光团的系统，需要带通滤光片来阻挡 LED 发射任一边缘的波长区域。复用光学设计都需要带通滤光片具有极其锋利的边缘，以增加信噪比。有多种策略可用于多个 LED 照明。

1. 在打开和关闭的各个 LED（或激光器）前面使用单独的带通滤光片。
   1. LED 可以编程为快速脉冲。许多激光器也具有这种特性。
   2. LED 可以组合成单个光束（图 5a-下面进一步描述）或者可以在空间上分离（例如在流式细胞术或 PCR 系统中，如图 4 所示）。
   3. 无论选择何种滤光片，此选项都将实现高的 SNR，因为一次只有一个光源打开，从而减少了某些类别的激发串扰。
      
      

图 4. 一些脉冲激发策略：
(a) 样品在光源站之间移动；
(b) 光源布置在样品周围并闪烁。
探测器位于样品平面上方或下方。

2. 在组合光束中的各个 LED 前面使用单独的带通滤光片，同时进行照明。
   1. 可以通过使用二向色滤光片将光源对齐到单个光轴来实现光束组合（图 5a）。有关基于激光的示例， 请单击此处。
   2. 此选项的成功很大程度上取决于荧光团的不同激发光谱与各 LED 的重叠以及荧光信号的相对强度（图 6）。
   3. 光谱分离的 LED 和荧光团可提供好结果。
   4. 光谱解混算法可用于减少后处理期间的串扰。
      
   
   
3. 将 LED 光束与多波段滤光片进行过滤相结合，实现同步照明。
   1. 该方法使用的过滤元件少；需要二向色镜将光束合并到单轴上，并且在样品之前放置单个多带滤光片以清除 LED 激发通道之间的剩余串扰（图 5b）。
   2. 与第 2 点一样，成功取决于系统中 LED 和荧光团的选择以及相对信号强度。
   3. 在后处理步骤中可能需要光谱分解。

一些商用光源已经使用上述方法来提供可调节的多波段激发光（图 7）。值得注意的是，激发峰之间的漏光可以是 0.5% 或更多。通过添加额外的多带滤光片以增加通道之间的阻挡，可以进一步增强使用这些照明系统所产生的信噪比。

图 5. 将 LED 激发源组合成单个光轴。 LED 可以连续发光或以脉冲方式工作。 LED 通道之间的串扰可以通过单独的带通滤光片 (a) 或序列末尾的单个多带滤光片 (b) 来减少。

用于宽带照明的滤光片

白光和宽带光源，包括基于灯丝的黑体光源、弧光灯（氙、氘）等，是大约一百年来荧光照明的支柱，并且至今仍在大量使用。

在许多不太复杂的显微镜系统中。它们用途广，因为单个光源可产生大范围的波长。这种多功能性需要滤光片规格来选择性地传输选定的光。

为了有效地使用宽带源，在检测器响应曲线的整个波长范围内需要高带外阻挡，以减少检测通道中的串扰。这与 LED 光源不同，后者仅在 LED 发射的波长内需要高 OD 阻挡。

图 6当多个 LED 和荧光团一起使用时，通道之间的激发串扰可能会成为一个问题，其中一个通道的 LED 会激发来自不同通道的荧光团。为了获得大的信噪比，应尽量减少串扰。	图 7. 市售多 LED 光源的光谱输出。添加多频带滤光片将改善激励频带之间的带外阻挡和信噪比。

使用宽带光源进行多通道荧光会产生与上述多通道 LED 类似的问题。需要仔细选择激发和发射荧光滤光片和荧光团，以增加系统中的信号噪声比 SNR。

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