生命科学光学
什么是多光子显微镜?
在多光子显微镜（也称为非线性或双光子显微镜）中，以两倍正常激发波长照射样品。更长的波长是有利的，因为它们可以更深地穿透样品进行 3D 成像，并且因为它们不会损坏样品，从而延长样品寿命。为了实现多光子激发，照明光束在空间上聚焦（使用光学器件），同时使用高能短脉冲激发光束以提高两个（或更多）光子同时到达同一位置（即荧光团分子）的概率。
多光子显微技术的例子包括二次谐波产生 (SHG)、三次谐波产生 (THG)、相干反斯托克斯拉曼光谱 (CARS) 和受激发射耗尽 (STED) 显微技术。由于这些技术中的每一种都使用脉冲激光器，因此选择能够减少脉冲色散的光学组件很重要，并且激光反射二向色镜应具有低 GDD 特性。
图 1: 来自暴露的小鼠皮层的双色体内双光子成像。NADH 荧光（红色）和硫罗丹明标记的星形胶质细胞（绿色）使用 BrightLine FF01-680/SP 发射滤光片和 FF665-Di01 二向色镜拍摄。图片由罗切斯特大学医学中心神经外科系 Karl A. Kasischke 和 Nikhil Mutyal 提供。
如图 2 所示，典型的系统由激发激光器、扫描和成像光学器件、灵敏检测器（通常是光电倍增管）和用于将荧光与激光器分离并阻挡激光的滤光片（二向色镜分光片）、到达检测器（发射滤光片）组成。
多光子成像系统提供的优势包括：真正的三维成像、对活组织内部深处进行成像的能力以及消除平面外荧光。
使用这种方法，可以对斯托克斯位移非常短和/或效率非常低的荧光染料进行成像，甚至可以对样品或组织中固有的荧光分子进行成像。多光子成像的缺点包括：需要高峰值功率脉冲激光器，例如锁模钛：蓝宝石激光器，并且直到现在，缺乏在整个发射范围内提供足够吞吐量的滤光片。整个激光调谐范围内的兴趣和足够的阻挡（图 3）。
针对多光子显微镜优化的 Semrock 滤光片
Semrock 通过引入具有高透射率、非常陡峭的边缘和精心优化的阻挡的滤光片，为多光子用户带来了增强的性能。考虑到激发激光器和多光子成像系统的其他复杂元件通常需要多少投资，这些新的光学滤光片代表了一种简单且廉价的升级，可以显着提高系统性能。
BrightLine® 发射滤光片提供从近紫外到近红外的清晰透射（图 4）。事实上，与传统滤光片的褐色调相比，发射滤光片看起来像窗户玻璃一样清晰，而且 LWP 二向色镜具有如此宽的反射带，它们看起来像高反射镜（图 5）。发射滤光片还在 Ti:Sapphire 激光调谐范围内提供深度阻挡，这对于实现高信噪比和测量灵敏度至关重要。
有时需要限制在任何给定时间检测到的荧光发射光谱带，特别是当使用多个荧光团标记样品中的不同目标时。较窄的带通滤光片非常适合此目的，Semrock 提供了多种此类带通滤光片，可与多光子发射滤光片结合使用，几乎不会丢失荧光信号。
由于非线性光学效应强烈依赖于激光脉冲的峰值强度，因此当脉冲展宽（以及随之而来的峰值强度降低）保持在低值时，会产生有效的成像。BrightLine FF670-SDi01 和 FF720-SDi01 短波通二向色分束镜旨在将激发激光反射到样品，同时提供返回的近紫外和可见荧光或 SHG 信号的出色传输。与从这些分束镜反射的激光相关的群延迟色散 (GDD) 非常低。例如，对于 FF670-SDi01 滤光片，100 fs 变换限制高斯脉冲在整个激光波长范围内的加宽小于 2%，而对于 FF720-SDi01 滤光片在整个激光波长范围内的加宽远小于 1%。 在此处了解有关 GDD 的更多信息。
图 2: 多光子荧光显微镜的典型配置。
图 3: 多光子显微镜需要在非常宽的光谱范围内控制光：从近紫外一直到近红外。
图 4: BrightLine 多光子滤光片提供近乎理想的性能，如“近紫外和可见光”发射滤光片 FF01-680/SP 和二向色镜 FF665-Di01 的这些典型测量光谱所示。
图 5: BrightLine 多光子滤光片非常清晰！
图 6: 使用 Semrock 多光子滤光片研究表明荧光Ca2+ 指示剂蛋白（FCIPs），用于在使用双光子显微镜活细胞研究的Ca2+动态的功率。表达荧光蛋白 CerTN-L15 的 2/3 层神经元的三维重建。中间：3 张选定的图像（每张在左侧和右侧分别用数字标记的深度拍摄）。图片由慕尼黑工业大学神经科学研究所的 Olga Garaschuk 教授提供。（修改自 Heim 等人，Nat. Methods，4(2)：127-9，2007 年 2 月。）(Modified from Heim et al., Nat. Methods, 4(2): 127-9, Feb. 2007.)
成功案例：
Nature: Intravital three-photon microscopy allows visualization over the entire depth of mouse lymph nodes
Published: 17 January 2022 - Nature.com - Nature Immunology volume 23, P: 330-340
…Here, we used intravital three-photon microscopy to visualize the popliteal LN through its entire depth (600-900?μm). We determined the laser average power and pulse energy that caused measurable perturbation in lymphocyte migration....
了解有关多光子显微镜的更多信息：
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Nikon Microscopy U - 多光子激发显微镜的基础知识和应用