生命科学光学
适用于激光荧光显微镜的滤光片
近来，激光器开始作为 TIRF 和高分辨率成像的光源，这对成像系统及其组件施加了特定的限制。例如，与基于宽带光源的仪器中使用的滤光片相比，激光成像系统中使用的滤光片有特定的要求。 尽管有着不同的观点，但是光源消杂滤光片（激发滤光片）非常重要，可用于阻挡激光源在远离实际激光线的波长处的不需要的光， 这些不需要的光包括在固态激光器和气体激光器的等离子体线中观察到的自发辐射。此外，这些滤光片应足够耐久，以承受激光束的高强度。与使用了几十年的传统的软镀膜荧光滤光片不同，新型的 离子束溅射（IBS） 硬镀膜薄膜滤光片具有较高的激光损伤阈值（LDT）额定值。具有非常高的光学耐久性，再加上硬镀膜滤光片坚固的环境牢靠性，这种滤光片几乎不受热和湿度引起的降解影响，因此，如果使用离子束溅射硬镀膜滤光片，则无需在大多数荧光显微镜应用中更换滤光片。
激光应用的激发滤光片也有独特的波长要求。有些激光器，如气体激光器和 DPSS 激光器，具有非常精确和狭窄的激光线。然而，对于可能使用多个相似波长的激光器（如 473 nm 和
488 nm 用于激发 GFP ）的系统来说，选择窄激光线消杂滤光片并不合适。半导体激光器和光泵半导体激光器的光谱输出随温度和激光器的老化，在不同的激光器之间会有明显的变化。
因此，对于大多数激光显微镜系统而言，与宽带光源（如弧光灯）显微镜系统类似的更宽的激发滤光片是一个很好的解决方案。例如，Semrock 激光四带滤光片组 LF405/488/561/635-B 的紫外激发带设计用于 375 nm 和 405 nm 的激光器，较的长波长边缘就设计考虑到 405 nm 激光器波长的 ±5 纳米不确定性。
典型的发射滤光片应在所有可能与滤光片组一起使用的激光线上提供高阻挡（> OD 6），从而确保较暗的背景信号水平，同时提供发射信号的良好透过率。应该注意的是，并非所有宽带光源的发射滤光片都能在激光线处提供足够的阻挡，当阻挡不够时，会导致成像质量的明显降低。
用于激光应用的二向色镜分束镜 不仅应使其反射和透射带与激发和发射滤光片兼容，而且还需要镀上抗反射镀膜，以透过发射信号并消除相干干扰伪影。由于二向色镜分束镜直接暴露在强激发光束中，即使来自滤光片的微弱的自发荧光也会污染发射光， 所以，滤光片的基材应使用具有低自发荧光的基底，如熔石英。
在某些应用中，二向色镜对图像质量有着重要的影响，特别是当二向色镜的平整度（或曲率）不合适时。对于大多数激光显微镜应用，二向色镜应足够平，使照明激光束的焦点没有明显的位移，焦点位移通常是由瑞利（Rayleigh）范围定义的。这对于高分辨率应用至关重要。如 如TIRF、共聚焦、Palm、Storm、SIM等。
要求很高的应用，如使用 TIRF 技术的单分子成像可能要求对发射通道中的激光束阻挡施加阻挡，同时从荧光染料收集每一个可能的光子。在这种情况下，传统的带通发射滤光片可以被锁定在特定激光线上的长波通滤光片所取代。 在我们的观察中，TIRF 系统甚至受益于将第二个发射滤光片与激光滤光片组的所有滤光片结合使用。第二个滤光片的主要目的是确保高角度散射激发光不会穿过整个成像路径到达探测器，该滤光片应与另一个发射滤光片物理分离。
传统的显微镜激发块镜盒（或称为立方体），可以显著降低二向色镜分束镜的平整度，从而导致像差的产生。但是，TIRF 和高分辨率成像系统对光学波前畸变非常敏感，需要高质量的元件来获得更好的仪器灵敏度。我们的 TIRF 和高辨率显微镜立方体（包含滤光片组和激发块镜盒组装调试好）提供 1λ P-V RWE，并针对此类应用进行了优化。
总的来说，激发和发射滤光片的设计以及二向色镜分束镜的设计应该相互补充，以获得高真度的荧光可视化效果。光学滤光片在从复杂、昂贵的激光显微镜中获得性能方面起着至关重要的作用，而投资于与成像系统性能匹配的滤光片是非常有意义的。