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使用 Avant™ 滤光片组，增加荧光性能
2023 年 9 月 3 日 作者：IDEX Health & Science
Semrock ® Avant™ 滤光片组系列的每个成员都为其相应的短斯托克斯位移荧光团提供了显着的荧光性能改进。我们介绍这一发展背后的基本原理以及它是如何实现的。
该产品系列近日新增：m-Cherry 及类似荧光染料适用的滤光片组。
Avant™ 系列的每个滤光片组为其相应的短斯托克斯位移荧光团提供了荧光性能的显著改进。以下是这一发展背后的基本原理，以及它是如何实现的。
基本原理
生物显微镜中使用的荧光滤光片组由以下部分组成：
- 激发滤光片，限制激发光的波长范围
- 二向色镜分色滤光片，将激发光反射到样品，并将较长波长的发射光传输到探测器
- 发射滤光片，将发射荧光的有限波长范围传递到探测器
激发通带位于荧光团的激发光谱上方，发射通带位于发射光谱上方。这里的问题是这些通带的好的放置以及它如何取决于斯托克斯位移的大小。
斯托克斯位移是峰值激发波长和发射波长之间的波长间隔。具有大斯托克斯位移的荧光团具有广泛分离的激发和发射峰值，并且滤光片通带可以以峰值激发和发射波长为中心，以优化大发射信号和小渗透到发射通道的激发光。然而，流行的短斯托克斯位移荧光团的滤光片通带边缘靠近放置，因此通常需要在信号和渗透之间进行折衷，如下所示。
短斯托克斯位移荧光团的滤光片通带的通常排列如图 1 所示。接近交叉波长的激发和发射光谱边缘被称为“临界边缘”。在当前实践中，临界边缘之间所谓的间隙通常相对于荧光团的交叉波长很不对称地定位。这种不对称性将发射器通带推向更长的波长，导致发射滤光片捕获的发射光减少，从而降低滤光片组的性能。
图 1：具有相应激发和发射滤光片（黑色实线）的荧光团的激发（红色虚线）和发射（红色实线）光谱示意图。
由于两个原因，差距难以缩小。与短斯托克斯位移荧光团相关的窄间隙导致更高水平的激发光渗透，即激发光从样本平面反射到发射滤光片中。其次，两个关键边缘不得放置得太近，因为生产变化导致的位置变化可能会导致阻塞减少。尽管 Semrock 过滤器在生产批次内和批次之间提供了好的边缘放置一致性，但关键边缘的更紧密放置需要对生产中的边缘放置精度进行改进。
由于所描述的性能缺陷适用于大量流行的短斯托克斯位移荧光团，因此整个行业中相应滤光片组的系统性性能不佳。由于 IDEX Health & Science 在改进 Semrock 光学滤光片涂层性能和计量能力方面取得了长足进步，我们着手改进短斯托克斯位移荧光团（即相对于交叉点位移小于 3% 的荧光团）的滤光片组的性能波长。这些改进现已在 Avant 过滤器套件系列中提供。
范例
使用三个步骤来应对上述限制：
- 激发滤光片和发射滤光片的两个相邻通带边缘的光谱边缘与标准滤光片组中的值相比明显变陡。
- 一旦边缘变陡，两个相邻边缘就移得更近。
- 在激发滤光片和发射滤光片中实施了深度互补阻断（OD 10，设计规范），以减少激发光泄漏。
Semrock 新的关键自有工艺进步实现了这一目标：
结果
建模工具使用了 SearchLight™ 建模工具 使用新 Avant™ 滤光片组的测量光谱进行建模，总结如下表所示。荧光的改变是显著的，如右边的一列所示，通过的激发光（如荧光百分比增加左边的一列中所示）已被有效减少。| 荧光探针 | 激发光源 | 滤光片组 | 荧光信号 × 106 | 激发光串扰 × 109 | 使用 Avant 荧光信号改变 |
|---|---|---|---|---|---|
| Venus | 525 nm LED (X-Cite Turbo) | LED-Venus-A Avant Venus-YFP |
3.07 3.56 | 2.70
< 10-4 | 16% |
| Cy3 | 575 nm LED (X-Cite Turbo) | Cy3-4040C Avant Cy3 | 1.56 2.28 | 4.10 < 10-4 | 46% |
| Cy5.5 | 655 nm Lumiled LXM3-PD01 | Cy5.5-C Avant Cy5.5 | 1.76 2.30 | 1.20 < 10-4
| 31% |
| Cy7 | 740 nm CoolLED | LED-Cy7-A Avant Cy7 | 4.28 5.38 | 5.20 < 10-4 | 26% |
早期结果表明，与现有 BrightLine™ 滤光片组相比，Avant™ 滤光片时，荧光信号强度显著增加。
总结
Avant™ 滤光片组系列提供了改进的荧光信号和信噪比，为优先考虑效率、速度和性能的应用领域提供了更好的方案。此外，Avant 使用的工艺现在可用于定制滤光片和滤光片组的设计。我们欢迎使用荧光工具的 OEM 开发人员的咨询。