特色故事
使用 Avant™ 滤光片组，增加荧光性能
Avant™ 系列的每个滤光片组为其相应的短斯托克斯位移荧光团提供了荧光性能的显著改进。以下是这一发展背后的基本原理，以及它是如何实现的。
根本原因
荧光滤光片组由以下部件组成：
- 激发滤光片，限制激发光的波长范围
- 二向色镜分色滤光片，将激发光反射到样品，并将较长波长的发射光传输到探测器
- 发射滤光片，将发射荧光的有限波长范围传递到探测器
在荧光滤光片组中，激发通带位于荧光团的激发光谱，而发射通带位于荧光团的发射光谱。
我们设置两个通带以获得更佳结果的能力取决于斯托克斯位移，即荧光团的峰值激发波长和峰值发射波长之间的纳米间隔。许多流行的荧光探针具有较小的斯托克斯位移，小于其波长的 3%。尽管这些探针的激发和发射通带通常会放在一起，但并非如此。
相反，我们看到了这些短斯托克斯-位移荧光团的更典型的模式，如图 1 所示。长波长激发通带边缘和短波长发射通带边缘之间的所谓间隙相对于荧光团的交叉点非常不对称，在该交叉点，归一化的激发和发射曲线交叉。
图 1
这种不对称性将发射滤光片通带向外推到更长的波长，结果是发射滤光片捕获的发射光更少，滤光片组性能降低。由于两个原因，间隙很难减小：（1）减小的间隙导致较高水平的激发光通过，即从样品平面反射到发射滤光片中的激发光，以及（2）制造可变性限制了我们将两个光谱边缘放置在狭窄间隙中的能力，而不会冒着两个滤光片边缘在较深 OD 处发生交叉的风险。
由于这种性能缺陷适用于许多流行的荧光团，因此在整个行业中，相应的滤光片组系统性地表现不佳。随着 IDEX Health & Science 在改变 Semrock 品牌的滤光片镀膜性能和计量能力方面取得了长足进步，我们着手改变短斯托克斯变换荧光团滤光片组的性能。这就产生了 Avant™ 滤光片组系列。
范式
使用三个步骤来解决上述限制：
- 激发滤光片和发射滤光片的两个相邻通带边缘的光谱边缘与标准滤光片组中的值相比明显变陡。
- 一旦边缘变陡，两个相邻边缘就移得更近。
- 在激发滤光片和发射滤光片中实施了深度互补阻断（OD 10，设计规范），以抑制激发光泄漏。
Semrock 新的关键自有工艺进步实现了这一目标：
结果
如下图所示，图 2 在建模工具中显示了 Cy5.5 荧光团荧光发射信号的增加。
图 2
建模工具使用了 SearchLight™ 建模工具 使用新 Avant™ 滤光片组的测量光谱进行建模，总结如下表所示。荧光的改变是显著的，如右边的一列所示，通过的激发光（如荧光百分比增加左边的一列中所示）已被有效消除。
| 荧光探针 | 激发光源 | 滤光片组 | 荧光信号 × 106 | 激发光串扰 × 109 | 使用 Avant 荧光信号改变 |
|---|---|---|---|---|---|
| Venus | 525 nm LED (X-Cite Turbo) |
LED-Venus-A
Avant Venus-YFP
|
3.07
3.56
|
2.70
< 10-4
|
16% |
| Cy3 | 575 nm LED (X-Cite Turbo) |
Cy3-4040C
Avant Cy3
|
1.56
2.28
|
4.10
< 10-4
|
46% |
| Cy5.5 | 655 nm Lumiled LXM3-PD01 |
Cy5.5-C
Avant Cy5.5
|
1.76
2.30
|
1.20
< 10-4
|
31% |
| Cy7 | 740 nm CoolLED |
LED-Cy7-A
Avant Cy7
|
4.28
5.38
|
5.20
< 10-4
|
26% |
早期结果表明，使用 Cy5.5 的 Semrock 客户，与现有 BrightLine™ 滤光片组相比，使用 Cy5.5 Avant™ 滤光片时，荧光信号强度增加了约 40%。
总结
Avant™ 滤光片组系列提供了改进的荧光信号和信噪比，为优先考虑效率、速度和性能的应用领域提供了更好的方案。此外，Avant 使用的工艺现在可用于定制滤光片和滤光片组的设计。我们欢迎使用荧光工具的所有 OEM 开发人员的咨询。